Анализа јавних података
Подаци о линијама САРС-ЦоВ-2 и датум када је узорак узет из секвенци доступних из Чилеа добијени су са Цонсорцио Геномас ЦоВ2 сајта доступног на https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Подаци о вакцинацији су добијени из јавних података Министарства науке, технологије, знања и иновација доступних на адреси https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Производ 83).
Тест инфективности
Псеудотиповани вируси који носе различите САРС-ЦоВ-2 шиљасте протеине припремљени су као што смо претходно описали12. Укратко, псеудотипови САРС-ЦоВ-1 засновани на ХИВ-2 произведени су у ћелијама ХЕК293Т трансфекцијом пНЛ4.3-ΔЕнв-Луц заједно са одговарајућим вектором за кодирање пЦДНА-САРС-ЦоВ-2 Спике у моларном односу 1:1. Плазмиди који кодирају кодон-оптимизован шиљак којем недостаје последњих 19 аминокиселина на крају Ц-терминала (СΔ19) за које је познато да избегавају задржавање у ендоплазматском ретикулуму12 добијени су синтезом гена или прилагођеном мутагенезом усмереном на место (ГенеСцрипт) и садржали су следеће мутације: линија А (референтна секвенца), линија Б (Д614Г), линија Б.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, Н501И, А570Д, Д614Г, П681Х, Т716И, С982А, Д1118Х), лоза П.1 (Л18Ф, Т20Н, П26С, Д138И, Р190С, К417Т, Е484К, Н501И, Д614Г, Х655И, Т1027, линија Т37) 75- 76, Л246К, Ф252С, Д452Г, Т490Н). Сваки псеудотипски препарат је очишћен центрифугирањем на 614 рпм на собној температури, квантификован коришћењем ХИВ-859 Гаг п3,000 Куантикине ЕЛИСА комплета (Р&Д Системс), аликвотиран у 1% феталног говеђег серума (Сигма-Алдрицх) и чуван на -24 °Ц до користити. Различите количине псеудотипованих вируса (како је одређено нивоима ХИВ-50 п80 протеина) коришћене су за инфицирање ћелија ХЕК-АЦЕ1 и 24 сати касније мерена је активност луциферазе свице помоћу реагенса за испитивање луциферазе (Промега) у Гломак 2 микроплочи. луминометар (Промега).
Неутрализацијски тест
Псеудотипизовани тестови неутрализације вируса су изведени у суштини као што смо претходно описали12. Укратко, серијска разблажења узорака плазме (1:4 до 1:8748) припремљена су у ДМЕМ са 10% феталног говеђег серума и инкубирана са 5 нг п24 сваког псеудотипованог вируса током 1 х на 37 °Ц, а затим, 1×104 ХЕК-АЦЕ2 ћелија су додати у сваки бунар. ХЕК293Т ћелије (које не експримирају АЦЕ2) инкубиране са псеудотипизованим вирусом (лоза А) коришћене су као негативна контрола. Ћелије су лизиране 48 сати касније, а активност луциферазе кријеснице је мерена коришћењем реагенса за испитивање луциферазе (Промега) у луминометру Гломак 96 Мицроплате (Промега). Проценат неутрализације за свако разблаживање је израчунат и ИД50 сваког узорка је израчунат коришћењем ГрапхПад Присм верзије 9.0.1.
статистичке анализе
Статистичке анализе су обављене коришћењем софтвера ГрапхПад Присм верзије 9.1.2. Вишеструка групна поређења за неутрализујући титар антитела (НАбТс) против панела САРС-ЦоВ-2 псеудотипованих вируса, као и поређења НАбс одговора према полу и статусу дима су обављена коришћењем упареног Вилцокон-овог теста рангирања са потписом. Промена фактора је израчуната као разлика средњег геометријског титра у ИД50 у поређењу са вирусом дивљег типа псеудотипа. Анализа корелације између НАбТ и старости или БМИ је спроведена коришћењем Спеармановог теста. Једносмерни АНОВА и Тукеи-јев тест вишеструког поређења су изведени за статистичку анализу инфективности. П вредност ≤0.05 сматрана је статистички значајном.
Етичко одобрење
Протокол студије је одобрио Етички комитет Медицинског факултета на Универсидад де Цхиле (пројекти бр. 0361-2021 и бр. 096-2020) и клиника Санта Мариа (пројекат бр. 132604-21). Сви донатори су потписали информирани пристанак, а њихови узорци су анонимни.
Утицај мутација шиљака у Ламбда варијанти на инфективност и реакције неутралисања антитела
Анализа 3695 секвенци из Чилеа депонованих у ГИСАИД-у до 24. јунаth 2021. показује јасну доминацију САРС-ЦоВ-2 варијанти Гама и Ламбда током последњег тромесечја, заједно са 79% свих секвенци.
Занимљиво је да је овај период окарактерисан масовном кампањом вакцинације у којој је 65.6% циљне популације (18 година и старији појединци) примило комплетну шему вакцинације до 27.th 2021
С обзиром да је 78.2% људи инокулисаних комплетном шемом примило инактивирану вирусну вакцину ЦоронаВац од Синовац Биотецх-а, покушали смо да истражимо утицај шиљастих мутација присутних у Ламбда варијанти на неутрализујући капацитет антитела изазваних овом вакцином.
За ово смо генерисали псеудотипне вирусе САРС-ЦоВ-1 засноване на ХИВ-2 који носе шиљасти протеин из референтне лозе Вухан-1 (Дивљи тип; лоза А), Д614Г мутације (лоза Б) и Алфа (лоза Б) .1.1.7), Гама (лоза П.1) и Ламбда (лоза Ц.37) варијанте.
Током припреме вируса, доследно смо приметили да ћелије инфициране псеудотипизованим вирусом који носи Ламбда шиљак дају значајно веће вредности биолуминисценције у поређењу са Д614Г мутантом или Алфа и Гама варијантама што указује на повећану инфективност изазвану Ламбда шиљком.
Слика КСНУМКС.Инфективност посредована различитим протеинима шиљака.
(А) Шематски приказ шиљастог протеина САРС-ЦоВ-2 и варијанти које су коришћене у овој студији. Линије су наведене у загради. РБД, рецептор-везујући домен, ЦМ; цитоплазматски реп.
(Б) Титрација псеудотипова сваке лозе коришћењем еквивалентних количина ХИВ-1 п24. Активност луциферазе кријеснице мерена је као релативне јединице луминисценције (РЛУ) 48 сати након инфекције. Просек и СД су израчунати из репрезентативног експеримента у три примерка.
Затим смо користили горе поменуте псеудотипизоване вирусе да бисмо извршили тестове неутрализације користећи 79 узорака плазме здравих здравствених радника са Универсидад де Цхиле и Цлиница Санта Мариа у Сантјагу, Чиле.
Искључили смо 4 узорка јер нисмо били у могућности да израчунамо ИД50 титар. Од анализираних узорака, 73% је одговарало женама, средње старости 34 године (ИКР 29 – 43) и телесног мак индекса (БМИ) од 25 (ИКР 22.7 – 27). 20.5% учесника се изјаснило да су активни пушачи док је трајао период имунизације. Узорци су добијени у просеку од 95 дана (ИКР 76 – 96) након друге дозе ЦоронаВац вакцине
Приметили смо да је неутрализација псеудотипованог вируса који носи шиљасти протеин дивљег типа резултирала 50% инхибиторним разблажењем (ИД50) Средњи титар од 191.46 (154.9 - 227.95, 95% ЦИ,), док је то било 153.92 (115.68 - 192.16, 95% ЦИ), 124.73 (86.2 - 163.2, 95% ЦИ), 104.57 (75.02 - 134.11, 95% ЦИ) ) и 78.75 (49.8 – 107.6, 95% ЦИ) за псеудотиповане вирусе који носе шиљасти протеин из Д614Г мутанта или алфа, гама и ламбда варијанте, респективно.
Такође смо приметили да је геометријски средњи титар ИД50 титри су смањени за фактор 3.05 (2.57 – 3.61, 95% ЦИ) за псеудотиповани вирус који носи ламбда шиљак, 2.33 (1.95 – 2.80, 95% ЦИ) за гама шиљак, 2.03 (1.71, 2.41) ЦИ за Алпха спике и 95 (1.37 – 1.20, 1.55% ЦИ) за Д95Г шиљак у поређењу са шиљком Вилд типа.
У нашој студијској кохорти није уочена корелација између пола, старости, индекса телесне масе (БМИ) или статуса дима и титра неутрализујућих антитела.
Слика КСНУМКС.Тест неутрализације коришћењем узорака плазме од ЦоронаВац вакцинисаних
(А) Промене у реципрочном титру неутрализације од 50% (ИД50) у узорцима плазме од 75 прималаца вакцине ЦоронаВац против Д614Г (лоза Б), Алпха (лоза Б.1.1.7),
Гама (лоза П.1) и Ламбда (лоза Ц.37) варијанте у поређењу са вирусом дивљег типа. Резултати су приказани као разлика у титрима неутрализације одговарајућих узорака. П вредности за поређење ИД50 израчунавају се Вилкоксоновим тестом са предзнаком.
(Б) Бокс дијаграми су указивали на медијану и интерквартилни опсег (ИКР) ИД-а50 за сваки псеудотиповани вирус. Промене фактора су приказане као разлика геометријског средњег титра у ИД-у50 у поређењу са онима за псеудотипизовани вирус дивљег типа. Статистичке анализе су обављене коришћењем Вилцокон теста подударних парова предзнака.
Заједно, наши подаци су открили да шиљасти протеин новопризнате варијанте од интереса Ламбда, који високо циркулише у Чилеу и земљама Јужне Америке, носи мутације које дају повећану инфективност и способност да побегну од неутрализујућих антитела изазваних ЦоронаВац.
